Sådan fremstilles en fosfatbufret saltopløsning

Fosfatbufret saltvand eller PBS-opløsning er en pH-bufferopløsning, der almindeligvis anvendes i biologiske laboratorier over hele verden. Det er en opløsning af forskellige salte, der har syre/base-parret dihydrogenphosphat/hydrogenphosphat (H ₂ PO ₄ ^-/ HPO ₄ ^– ) som buffersystem. Dette buffersystem er ideelt til at udføre eksperimenter af biologisk og medicinsk karakter, da dihydrogenphosphat (også kaldet disyrefosfat) har en pKa på 7,2, så en ækvimolær opløsning af det konjugerede par regulerer pH omkring 7. .2, hvilket simulerer tilstrækkeligt menneskets fysiologiske pH.

Ud over at modellere pH-værdien af ​​forskellige kropsvæsker korrekt, har PBS-opløsningen også nogle opløste salte, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid og i nogle tilfælde calcium- og magnesiumchlorid. Tilsammen giver saltene og fosfaterne opløsningen en osmolaritet svarende til blodplasma (omkring 290 mOsm/L), hvilket gør den til en isotonisk opløsning, ideel til at studere celler og andre systemer under fysiologiske forhold.

Sammensætning af PBS-bufferen

Der er forskellige formuleringer, der falder ind under kategorien fosfatbufret saltvand.

Denne opløsning skal som minimum indeholde natriumchlorid som hovedsalt (hvorfra udtrykket saltvand kommer fra), og den skal desuden indeholde mindst et salt af en af ​​de to komponenter i buffersystemet. Det kunne være natrium- eller kaliumdihydrogenphosphat, eller natrium- eller kaliumhydrogenphosphat kunne også anvendes.

I det første tilfælde skal der også tilsættes en stærk base såsom natriumhydroxid for at neutralisere halvdelen af ​​syresaltet og dermed generere det komplette buffersystem. I det andet tilfælde starter vi kun i nærværelse af det basiske salt, så vi skal neutralisere halvdelen af ​​det for at generere nok konjugeret syre.

Et typisk eksempel på sammensætningen af ​​en af ​​disse PBS-opløsninger er:

• Natriumchlorid (NaCl) 140 mM.
• 12 mM natriumhydrogenphosphat.
• Saltsyre indtil den ønskede pH-værdi.

Men i det mest almindelige tilfælde forsøger PBS-opløsningen så meget som muligt at simulere egenskaberne ved biologiske væsker, som omfatter andre ioner end natrium, de forskellige fosfater og chlorider. Af denne grund er PBS-løsninger normalt lidt mere komplekse end beskrevet ovenfor. I opløsningerne, hvis fremstilling er beskrevet nedenfor, er de endelige koncentrationer af de relevante ioniske arter før justering af pH:

_{Den særlige koncentration af hydrogenphosphat (HPO 4} ^2- ) og dihydrogenphosphat (H ₂ PO ₄ ^– ) ioner , de dominerende arter i ligevægt ved pH-værdier nær 7, vil afhænge af den særlige pH, som opløsningen er justeret til. For eksempel, hvis pH bringes til 7,2, pKa af dihydrogenphosphat, vil begge ioner være i et 1:1 forhold med koncentrationer omkring 5,9 mM.

Det følgende er protokollen til fremstilling af en typisk PBS-opløsning til laboratoriebrug, der ud over fosfater, chlorider og natriumioner også indeholder kalium-, calcium- og magnesiumioner.

Fremstilling af fosfatbufret saltvand

Der er to typiske måder at fremstille en PBS-opløsning til brug i et biologi-, medicin- eller biokemisk laboratorium: ved at veje og direkte opløse de nødvendige salte eller ved at fortynde en mere koncentreret opløsning.

Begge procedurer giver det samme resultat, men den anden er meget mere praktisk i laboratorier, hvor denne løsning bruges ofte. Dette skyldes, at ved kun at tilberede én koncentreret opløsning, kan enhver nødvendig fortynding hurtigt fremstilles på det tidspunkt, det er nødvendigt, en procedure, der er meget hurtigere og mindre udsat for fejl end at veje og opløse 4 til 6 forskellige salte hver gang en opløsning skal forberedes.

Fremstilling af en 1x PBS-opløsning ved direkte vejning

Følgende tabel indeholder masserne af de forskellige komponenter, der skal vejes for at fremstille 250 mL, 500 mL og 1 L standard PBS-opløsning med en pH mellem 7,2 og 7,4 og en osmolaritet på ca. 290 mOsm/L. Denne opløsning kaldes normalt PBS 1x, da det er den med den passende koncentration til brug i forsøg.

forberedelsesprotokol

Fremstillingen af ​​disse opløsninger udføres ved hjælp af følgende trin:

1. Alle salte vejes separat ved hjælp af en analytisk vægt.
2. I et bægerglas eller bægerglas af passende størrelse tilsættes vand for at udgøre op til fire femtedele af det samlede volumen af ​​opløsningen, der skal tilberedes (200 ml vand til 250 ml opløsningen, 400 ml for 500 ml opløsningen eller Brug om muligt ultrarent (deioniseret) vand. Det er ikke nødvendigt at måle denne mængde vand meget nøjagtigt.
3. Tilsæt de tidligere afvejede salte en efter en og ryst med en magnetomrører eller en glasstav, indtil de er helt opløst. Den resulterende opløsning bør have en mere alkalisk pH på omkring 7,8 eller 7,9.
4. Ved hjælp af et pH-meter eller pH-meter og under konstant omrøring tilsættes 0,1 M saltsyre (HCl) opløsning, indtil den ønskede pH er nået. For at nå en pH-værdi på ca. 7,4 i 1 L-opløsningen, vil det være nødvendigt med ca.
5. Når den ønskede pH er nået, overføres opløsningen til en målekolbe med passende kapacitet (250 ml, 500 ml eller 1 L, alt efter tilfældet).
6. Når den er i målekolben, tilsættes ultrarent vand op til målemærket.
7. Med ballonproppen på plads, ryst opløsningen for at sikre, at opløsningen er homogen.

Fremstilling af en 10x PBS-opløsning ved direkte vejning

10x PBS-opløsningen er en ti gange mere koncentreret version af standardopløsningen. Denne opløsning bruges ikke til at udføre eksperimenter, men som en koncentreret opløsning til fremstilling af standardopløsningen ved fortynding.

Følgende tabel indeholder masserne af de forskellige komponenter, der skal vejes for at fremstille 250 ml, 500 ml og 1 L 10x PBS-opløsning med en pH mellem 7,2 og 7,4 og en osmolaritet på ca. 2,90 Osm/L.

forberedelsesprotokol

Fremstillingen af ​​en hvilken som helst af de koncentrerede opløsninger udføres ved at følge de samme trin som i det foregående tilfælde. De eneste vigtige ændringer er masserne af de opløste stoffer, som er ti gange større.

På den anden side, da det er en meget mere koncentreret opløsning, bør pH-justeringen også udføres med en mere koncentreret HCl-opløsning, helst 1 M. Den bør ikke udføres med den samme 0,1 M opløsning, da det volumen, der vil være nødvendig for at nå en pH mellem 7,2 og 7,4 vil ende med at overstige det endelige totale volumen af ​​den opløsning, du vil forberede.

Fremstilling af 1x PBS-opløsning ved fortynding af 10x opløsning

Den 10x koncentrerede opløsning beskrevet i det foregående afsnit bruges som stam- eller moderopløsning til fremstilling på stedet af små mængder 1x PBS-opløsning. Følgende tabel angiver mængden af ​​koncentreret opløsning, der skal måles i henhold til mængden af ​​1x PBS-opløsning, som du ønsker at forberede.

forberedelsesprotokol

I alle tilfælde kræver fremstillingen af ​​fortyndingerne brug af en volumetrisk pipette, hvis kapacitet er lig med volumenet af den 10x opløsning, der skal måles, samt en målekolbe, hvis volumen svarer til den mængde opløsning, der ønskes. forberede.

Trinene er følgende:

1. Kontroller, at den koncentrerede opløsning ikke er udfældet. Hvis det er tilfældet, ryst det, indtil det er helt opløst.
2. Hæld en lidt større mængde af 10x PBS-opløsningen, der skal måles, i et bægerglas af passende størrelse.
3. Mål det tilsvarende volumen af ​​den koncentrerede opløsning ved hjælp af en passende volumetrisk pipette (som beskrevet ovenfor) og tilsæt den til den passende målekolbe.
4. Tilsæt vand op til kapacitetsmærket.
5. Med ballonproppen på plads, ryst opløsningen for at sikre, at opløsningen er homogen.

Sterilisering og opbevaring af PBS-løsninger

Selvom disse opløsninger næsten altid kan anvendes umiddelbart efter tilberedning, kræver nogle påføringer af fosfatpufret saltvand, at det steriliseres først. I disse tilfælde er en 20 minutters sterilisering i en autoklave ved 15 psi tilstrækkelig.

Med hensyn til opbevaring kan både 1x og 10x PBS opløsninger opbevares ved stuetemperatur.

Om nødvendigt kan de også opbevares på køl for at forlænge holdbarheden. I tilfælde af standardløsningen volder køling ikke noget problem. Men i tilfælde af 10x-opløsningen, som er en relativt koncentreret opløsning, kan afkøling forårsage udfældning af nogle salte, især hvis opløsningen indeholder calcium og magnesium.

Udfældning er normalt ikke et problem, så længe der tages skridt til at genopløse alle opløste stoffer, før denne opløsning bruges til at forberede de respektive fortyndinger. For at opnå dette er det tilstrækkeligt at lade opløsningen nå stuetemperatur og derefter ryste den, indtil alle de dannede faste stoffer er opløst. Om nødvendigt kan opløsningen også opvarmes lidt for at hjælpe med at opløse de opløste stoffer hurtigere.

Referencer

AAT Bioquest, Inc. (2021, 20. oktober). PBS (Phosphate Buffered Saline) (1X, pH 7,4).» . Hentet fra https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/pbs-phosphate-buffered-saline

Checa R., A. (2017, 13. december). Metode: Fosfatbufferopløsning (PBS) . ved godt. http://conogasi.org/articulos/metodo-disolucion-amortiguadora-de-fosfastos-pbs/

Gil, M. (2019, 17. april). Fosfatbuffer (PBS): begrundelse, fremstilling og anvendelser . livsvarigt. https://www.lifeder.com/buffer-phosphates/