Cum se prepară o soluție salină tamponată cu fosfat

Soluția salină tamponată cu fosfat, sau soluția PBS, este o soluție tampon pentru pH utilizată în mod obișnuit în laboratoarele de biologie din întreaga lume. Este o soluție de diferite săruri care are ca sistem tampon perechea acid/bază dihidrogen fosfat/hidrogen fosfat (H ₂ PO ₄ ^-/ HPO ₄ ^{– ).} Acest sistem tampon este ideal pentru realizarea de experimente de natură biologică și medicală, deoarece fosfatul dihidrogen (numit și fosfat diacid) are un pKa de 7,2, deci o soluție echimolară a perechii conjugate reglează pH-ul în jurul valorii de 7. .2, simulând adecvat pH-ul fiziologic uman.

Pe lângă modelarea corectă a pH-ului diferitelor fluide corporale, soluția de PBS are și unele săruri dizolvate, cum ar fi clorura de sodiu, clorura de potasiu și, în unele cazuri, clorura de calciu și magneziu. Împreună, sărurile și fosfații oferă soluției o osmolaritate echivalentă cu cea a plasmei sanguine (aproximativ 290 mOsm/L), făcându-l o soluție izotonă, ideală pentru studiul celulelor și a altor sisteme în condiții fiziologice.

Compoziția tamponului PBS

Există diferite formulări care se încadrează în categoria soluției saline tamponate cu fosfat.

Această soluție trebuie să conțină cel puțin clorură de sodiu ca sare principală (de la care provine termenul de soluție salină) și trebuie să conțină, de asemenea, cel puțin o sare a unuia dintre cele două componente ale sistemului tampon. Ar putea fi fosfat dihidrogen de sodiu sau potasiu, sau fosfat acid de sodiu sau potasiu poate fi de asemenea utilizat.

În primul caz, trebuie adăugată și o bază puternică, cum ar fi hidroxidul de sodiu, pentru a neutraliza jumătate din sarea acidă și pentru a genera astfel sistemul tampon complet. În al doilea caz, începem în prezența doar a sării bazice, așa că trebuie să neutralizăm jumătate din aceasta pentru a genera suficient acid conjugat.

Un exemplu tipic de compoziție a uneia dintre aceste soluții PBS este:

• Clorura de sodiu (NaCI) 140 mM.
• 12 mM fosfat acid de sodiu.
• Acid clorhidric până la atingerea pH-ului dorit.

Cu toate acestea, în cel mai frecvent caz, soluția PBS încearcă să simuleze cât mai mult posibil caracteristicile fluidelor biologice, care includ alți ioni decât sodiul, diferiții fosfați și cloruri. Din acest motiv, soluțiile PBS sunt de obicei puțin mai complexe decât cele descrise mai sus. În soluțiile a căror preparare este descrisă mai jos, concentrațiile finale ale speciilor ionice relevante înainte de ajustarea pH-ului sunt:

Concentrația particulară de ioni de hidrogen fosfat (HPO ₄ ^2- ) și dihidrogen fosfat (H ₂ PO ₄ ^– ) , speciile dominante în echilibru la valori ale pH-ului apropiat de 7, va depinde de pH-ul particular la care este ajustată soluția. De exemplu, dacă pH-ul este adus la 7,2, pKa al fosfatului dihidrogen, ambii ioni vor fi într-un raport de 1:1 cu concentrații în jur de 5,9 mM.

Următorul este protocolul pentru prepararea unei soluții tipice de PBS pentru uz de laborator care, pe lângă fosfați, cloruri și ioni de sodiu, conține și ioni de potasiu, calciu și magneziu.

Prepararea soluției saline tamponate cu fosfat

Există două moduri tipice de a pregăti o soluție de PBS pentru utilizare într-un laborator de biologie, medicină sau biochimie: prin cântărirea și dizolvarea directă a sărurilor necesare sau prin diluarea unei soluții mai concentrate.

Ambele proceduri dau acelasi rezultat, dar a doua este mult mai practica in laboratoarele unde aceasta solutie este folosita frecvent. Acest lucru se datorează faptului că, prin prepararea unei singure soluții concentrate, orice diluție necesară poate fi pregătită rapid în momentul în care este nevoie, o procedură mult mai rapidă și mai puțin predispusă la erori decât cântărirea și dizolvarea a 4 până la 6 săruri diferite. trebuie să fie pregătit.

Prepararea unei soluții 1x PBS prin cântărire directă

Următorul tabel conține masele diferitelor componente care trebuie cântărite pentru a prepara 250 mL, 500 mL și 1 L de soluție standard de PBS cu un pH între 7,2 și 7,4 și o osmolaritate de aproximativ 290 mOsm/L. Această soluție este de obicei numită PBS 1x, deoarece este cea cu concentrația adecvată pentru utilizare în experimente.

protocol de pregătire

Prepararea acestor soluții se realizează prin următorii pași:

1. Toate sărurile sunt cântărite separat folosind o balanță analitică.
2. Într-un pahar sau un pahar de dimensiuni adecvate, adăugați apă pentru a face până la patru cincimi din volumul total al soluției de preparat (200 ml de apă pentru soluția de 250 ml, 400 ml pentru soluția de 500 ml sau Dacă este posibil, utilizați apă ultrapură (deionizată). Nu este necesar să măsurați această cantitate de apă foarte precis.
3. Se adaugă una câte una sărurile cântărite anterior și se agită cu un agitator magnetic sau cu o baghetă de sticlă până se dizolvă complet. Soluția rezultată ar trebui să aibă un pH mai alcalin de aproximativ 7,8 sau 7,9.
4. Folosind un pH-metru sau pH-metru și sub agitare constantă, se adaugă soluție de acid clorhidric (HCl) 0,1 M până când se atinge pH-ul dorit. Pentru a ajunge la un pH de aproximativ 7,4 în soluția de 1 L, vor fi necesare aproximativ 30 ml de HCl 0,1 M. Pentru celelalte două, vor fi necesare cantități proporțional mai mici.
5. Odată atins pH-ul dorit, se transferă soluția într-un balon cotat de capacitate adecvată (250 ml, 500 ml sau 1 L, după caz).
6. Odată ajuns în balonul cotat, adăugați apă ultrapură până la marcajul de măsurare.
7. Cu dopul balonului la loc, agitați soluția pentru a vă asigura că soluția este omogenă.

Prepararea unei soluții de PBS 10x prin cântărire directă

Soluția de 10x PBS este o versiune de zece ori mai concentrată a soluției standard. Această soluție nu este utilizată pentru a efectua experimente, ci ca soluție concentrată pentru a prepara soluția standard prin diluare.

Următorul tabel conține masele diferitelor componente care trebuie cântărite pentru a prepara 250 mL, 500 mL și 1 L de soluție 10x PBS cu un pH între 7,2 și 7,4 și o osmolaritate de aproximativ 2,90 Osm/L.

protocol de pregătire

Prepararea oricăreia dintre soluțiile concentrate se realizează urmând aceiași pași ca în cazul precedent. Singurele modificări importante sunt masele substanțelor dizolvate, care sunt de zece ori mai mari.

Pe de altă parte, deoarece este o soluție mult mai concentrată, ajustarea pH-ului trebuie efectuată și cu o soluție de HCI mai concentrată, de preferință 1 M. Nu trebuie efectuată cu aceeași soluție 0,1 M, deoarece volumul care va fi necesar pentru a ajunge la un pH între 7,2 și 7,4 va ajunge să depășească volumul total final al soluției pe care doriți să o pregătiți.

Prepararea soluției 1x PBS prin diluarea soluției 10x

Soluția concentrată 10x descrisă în secțiunea anterioară este utilizată ca soluție stoc sau mamă pentru prepararea pe loc a unor cantități mici de soluție 1x PBS. Următorul tabel indică cantitățile de soluție concentrată care trebuie măsurate în funcție de cantitatea de soluție 1x PBS pe care doriți să o pregătiți.

protocol de pregătire

În toate cazurile, prepararea diluțiilor necesită utilizarea unei pipete volumetrice a cărei capacitate este egală cu volumul soluției 10x de măsurat, precum și a unui balon cotat al cărui volum este egal cu cantitatea de soluție dorită. a pregati.

Pașii sunt următorii:

1. Verificați dacă soluția concentrată nu a precipitat. Dacă da, agitați-l până se dizolvă complet.
2. Se toarnă o cantitate puțin mai mare din soluția de PBS 10x care urmează să fie măsurată într-un pahar de laborator de dimensiuni adecvate.
3. Folosind o pipetă volumetrică cu volum adecvat (așa cum este descris mai sus) măsurați volumul corespunzător al soluției concentrate și adăugați-l în balonul cotat corespunzător.
4. Adăugați apă până la marcajul de capacitate.
5. Cu dopul balonului la loc, agitați soluția pentru a vă asigura că soluția este omogenă.

Sterilizarea si depozitarea solutiilor PBS

Deși aceste soluții pot fi folosite aproape întotdeauna imediat după preparare, unele aplicații de soluție salină tamponată cu fosfat necesită ca mai întâi să fie sterilizată. În aceste cazuri, este suficientă o sterilizare de 20 de minute într-o autoclavă la 15 psi.

În ceea ce privește depozitarea, atât soluțiile PBS 1x cât și 10x pot fi păstrate la temperatura camerei.

Dacă este necesar, pot fi păstrate și la frigider pentru a prelungi durata de valabilitate. În cazul soluției standard, răcirea nu creează nicio problemă. Totuși, în cazul soluției 10x, fiind o soluție relativ concentrată, răcirea poate provoca precipitarea unor săruri, mai ales dacă soluția conține calciu și magneziu.

Precipitația nu este în mod normal o problemă, atâta timp cât se iau măsuri pentru a redizolva toate substanțele dizolvate înainte de a utiliza această soluție pentru a pregăti diluțiile respective. Pentru a realiza acest lucru, este suficient să lăsați soluția să ajungă la temperatura camerei și apoi să o agitați până când toate solidele formate sunt dizolvate. Dacă este necesar, soluția poate fi încălzită ușor pentru a ajuta la dizolvarea mai rapidă a soluțiilor.

Referințe

AAT Bioquest, Inc. (20 octombrie 2021). PBS (soluție salină tamponată cu fosfat) (1X, pH 7,4).» . Preluat de la https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/pbs-phosphate-buffered-saline

Checa R., A. (2017, 13 decembrie). Metodă: Soluție tampon fosfat (PBS) . stiu. http://conogasi.org/articulos/metodo-disolucion-amortiguadora-de-fosfastos-pbs/

Gil, M. (2019, 17 aprilie). Tampon fosfat (PBS): justificare, preparare și utilizări . pe viaţă. https://www.lifeder.com/buffer-phosphates/