Cara menyiapkan larutan garam buffer fosfat

Saline buffered fosfat, atau larutan PBS, adalah larutan buffer pH yang biasa digunakan di laboratorium biologi di seluruh dunia. Ini adalah larutan dari berbagai garam yang memiliki pasangan asam/basa dihidrogen fosfat/hidrogen fosfat (H ₂ PO ₄ ^-/ HPO ₄ ^– ) sebagai sistem penyangga. Sistem penyangga ini sangat ideal untuk melakukan eksperimen biologis dan medis, karena dihidrogen fosfat (juga disebut diacid phosphate) memiliki pKa 7,2, sehingga larutan ekuimolar dari pasangan terkonjugasi mengatur pH sekitar 7. .2, mensimulasikan secara memadai pH fisiologis manusia.

Selain memodelkan pH berbagai cairan tubuh dengan benar, larutan PBS juga memiliki beberapa garam terlarut, seperti natrium klorida, kalium klorida, dan dalam beberapa kasus kalsium dan magnesium klorida. Bersama-sama, garam dan fosfat memberikan larutan dengan osmolaritas yang setara dengan plasma darah (sekitar 290 mOsm/L), menjadikannya larutan isotonik, ideal untuk mempelajari sel dan sistem lain dalam kondisi fisiologis.

Komposisi buffer PBS

Ada formulasi berbeda yang termasuk dalam kategori saline buffer fosfat.

Minimal, larutan ini harus mengandung natrium klorida sebagai garam utama (dari mana istilah larutan garam berasal) dan juga harus mengandung setidaknya satu garam dari salah satu dari dua komponen sistem penyangga. Ini bisa berupa natrium atau kalium dihidrogen fosfat, atau natrium atau kalium hidrogen fosfat juga dapat digunakan.

Dalam kasus pertama, basa kuat seperti natrium hidroksida juga harus ditambahkan untuk menetralkan setengah dari garam asam dan dengan demikian menghasilkan sistem penyangga yang lengkap. Dalam kasus kedua, kita mulai dengan adanya garam basa saja, jadi kita harus menetralkan setengahnya untuk menghasilkan asam konjugasi yang cukup.

Contoh khas komposisi salah satu solusi PBS ini adalah:

• Natrium klorida (NaCl) 140 mM.
• 12 mM natrium hidrogen fosfat.
• Asam klorida hingga mencapai pH yang diinginkan.

Namun, dalam kasus yang paling umum, larutan PBS mencoba mensimulasikan sebanyak mungkin karakteristik cairan biologis, yang mencakup ion selain natrium, berbagai fosfat, dan klorida. Untuk alasan ini, solusi PBS biasanya sedikit lebih rumit daripada yang dijelaskan di atas. Dalam larutan yang pembuatannya dijelaskan di bawah ini, konsentrasi akhir spesies ionik yang relevan sebelum penyesuaian pH adalah:

Konsentrasi khusus ion hidrogen fosfat (HPO ₄ ^2- ) dan dihidrogen fosfat (H ₂ PO ₄ ^– ) , spesies dominan dalam kesetimbangan pada nilai pH mendekati 7, akan bergantung pada pH tertentu yang disesuaikan dengan larutan. Misalnya, jika pH dibawa ke 7,2, pKa dihidrogen fosfat, kedua ion akan berada dalam rasio 1:1 dengan konsentrasi sekitar 5,9 mM.

Berikut ini adalah protokol pembuatan larutan PBS tipikal untuk penggunaan laboratorium yang, selain ion fosfat, klorida, dan natrium, juga mengandung ion kalium, kalsium, dan magnesium.

Persiapan garam buffer fosfat

Ada dua cara umum untuk menyiapkan larutan PBS untuk digunakan di laboratorium biologi, kedokteran, atau biokimia: dengan menimbang dan langsung melarutkan garam yang diperlukan, atau dengan mengencerkan larutan yang lebih pekat.

Kedua prosedur memberikan hasil yang sama, tetapi yang kedua jauh lebih praktis di laboratorium yang sering menggunakan larutan ini. Hal ini karena, dengan menyiapkan hanya satu larutan pekat, pengenceran apa pun yang diperlukan dapat disiapkan dengan cepat pada saat diperlukan, prosedur yang jauh lebih cepat dan lebih sedikit rawan kesalahan daripada menimbang dan melarutkan 4 hingga 6 garam yang berbeda. harus disiapkan.

Pembuatan larutan PBS 1x dengan penimbangan langsung

Tabel berikut berisi massa berbagai komponen yang harus ditimbang untuk menyiapkan 250 mL, 500 mL, dan 1 L larutan PBS standar dengan pH antara 7,2 dan 7,4 dan osmolaritas sekitar 290 mOsm/L. Larutan ini biasa disebut PBS 1x karena merupakan larutan dengan konsentrasi yang sesuai untuk digunakan dalam percobaan.

protokol persiapan

Persiapan solusi ini dilakukan melalui langkah-langkah berikut:

1. Semua garam ditimbang secara terpisah menggunakan timbangan analitik.
2. Dalam beaker atau beaker dengan ukuran yang sesuai, tambahkan air hingga empat perlima dari total volume larutan yang akan dibuat (200 mL air untuk 250 mL larutan, 400 mL untuk 500 mL larutan, atau Jika memungkinkan, gunakan air ultra murni (deionisasi). Tidak perlu mengukur jumlah air ini dengan sangat akurat.
3. Tambahkan garam yang telah ditimbang sebelumnya satu per satu dan kocok dengan pengaduk magnet atau batang kaca sampai benar-benar larut. Larutan yang dihasilkan harus memiliki pH yang lebih basa sekitar 7,8 atau 7,9.
4. Menggunakan pH-meter atau pH meter dan di bawah pengadukan konstan, tambahkan larutan asam klorida (HCl) 0,1 M sampai pH yang diinginkan tercapai. Untuk mencapai pH sekitar 7,4 dalam larutan 1 L, diperlukan sekitar 30 mL HCl 0,1 M. Untuk dua lainnya, jumlah yang lebih kecil secara proporsional akan dibutuhkan.
5. Setelah pH yang diinginkan tercapai, pindahkan larutan ke dalam labu volumetrik dengan kapasitas yang sesuai (250 mL, 500 mL atau 1 L, tergantung kasusnya).
6. Setelah berada di labu volumetrik, tambahkan air ultra murni hingga tanda pengukuran.
7. Dengan sumbat balon terpasang, kocok larutan untuk memastikan larutannya homogen.

Pembuatan larutan PBS 10x dengan penimbangan langsung

Solusi 10x PBS adalah versi solusi standar sepuluh kali lebih pekat. Larutan ini tidak digunakan untuk melakukan percobaan, tetapi sebagai larutan pekat untuk menyiapkan larutan baku dengan cara pengenceran.

Tabel berikut berisi massa berbagai komponen yang harus ditimbang untuk menyiapkan 250 mL, 500 mL, dan 1 L larutan PBS 10x dengan pH antara 7,2 dan 7,4 dan osmolaritas sekitar 2,90 Osm/L.

protokol persiapan

Persiapan salah satu larutan pekat dilakukan dengan mengikuti langkah yang sama seperti pada kasus sebelumnya. Satu-satunya perubahan penting adalah massa zat terlarut, yang sepuluh kali lebih besar.

Sebaliknya, karena merupakan larutan yang lebih pekat, penyesuaian pH juga harus dilakukan dengan larutan HCl yang lebih pekat, sebaiknya 1 M. Penyesuaian pH tidak boleh dilakukan dengan larutan 0,1 M yang sama, karena volume yang akan diperlukan untuk mencapai pH antara 7,2 dan 7,4 akan melebihi total volume akhir larutan yang ingin Anda siapkan.

Pembuatan larutan PBS 1x dengan pengenceran larutan 10x

Larutan pekat 10x yang dijelaskan di bagian sebelumnya digunakan sebagai stok atau larutan induk untuk persiapan di tempat sejumlah kecil larutan 1x PBS. Tabel berikut menunjukkan jumlah larutan pekat yang harus diukur sesuai dengan jumlah larutan 1x PBS yang ingin Anda siapkan.

protokol persiapan

Dalam semua kasus, persiapan pengenceran memerlukan penggunaan pipet ukur yang kapasitasnya sama dengan volume 10x larutan yang akan diukur, serta labu ukur yang volumenya sama dengan jumlah larutan yang diinginkan. mempersiapkan.

Langkah-langkahnya adalah sebagai berikut:

1. Pastikan larutan pekat belum mengendap. Jika sudah, kocok hingga benar-benar larut.
2. Tuangkan sedikit lebih banyak larutan 10x PBS untuk diukur ke dalam gelas kimia berukuran sesuai.
3. Menggunakan pipet volumetrik volume yang sesuai (seperti dijelaskan di atas) mengukur volume yang sesuai dari larutan pekat dan menambahkannya ke labu volumetrik yang sesuai.
4. Tambahkan air hingga tanda kapasitas.
5. Dengan sumbat balon terpasang, kocok larutan untuk memastikan larutannya homogen.

Sterilisasi dan penyimpanan larutan PBS

Meskipun larutan ini hampir selalu dapat digunakan segera setelah persiapan, beberapa aplikasi saline buffer fosfat mengharuskannya disterilkan terlebih dahulu. Dalam kasus ini, sterilisasi 20 menit dalam autoklaf pada 15 psi sudah cukup.

Mengenai penyimpanan, larutan PBS 1x dan 10x dapat disimpan pada suhu kamar.

Jika perlu, mereka juga dapat disimpan di bawah lemari es untuk memperpanjang umur simpannya. Dalam kasus solusi standar, pendinginan tidak menimbulkan masalah. Namun, dalam kasus larutan 10x, sebagai larutan yang relatif pekat, pendinginan dapat menyebabkan pengendapan beberapa garam, terutama jika larutan tersebut mengandung kalsium dan magnesium.

Pengendapan biasanya tidak menjadi masalah, asalkan diambil langkah-langkah untuk melarutkan kembali semua zat terlarut sebelum menggunakan larutan ini untuk menyiapkan masing-masing pengenceran. Untuk mencapai ini, cukup membiarkan larutan mencapai suhu kamar dan kemudian mengocoknya sampai semua padatan yang terbentuk larut. Jika perlu, larutan juga dapat dipanaskan sedikit untuk membantu melarutkan zat terlarut lebih cepat.

Referensi

AAT Bioquest, Inc. (2021, 20 Oktober). PBS (Saline Buffered Fosfat) (1X, pH 7,4).» . Diperoleh dari https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/pbs-phosphate-buffered-saline

Checa R., A. (2017, 13 Desember). Metode: Larutan penyangga fosfat (PBS) . tahu. http://conogasi.org/articulos/metodo-disolucion-amortiguadora-de-fosfastos-pbs/

Gil, M. (2019, 17 April). Buffer fosfat (PBS): dasar pemikiran, persiapan dan penggunaan . hidup. https://www.lifeder.com/buffer-phosphates/