Πώς να παρασκευάσετε ένα αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά

Artículo revisado y aprobado por nuestro equipo editorial, siguiendo los criterios de redacción y edición de YuBrain.


Ο φυσιολογικός ορός ρυθμισμένος με φωσφορικά, ή διάλυμα PBS, είναι ένα ρυθμιστικό διάλυμα pH που χρησιμοποιείται συνήθως σε εργαστήρια βιολογίας σε όλο τον κόσμο. Είναι ένα διάλυμα διαφορετικών αλάτων που έχει το ζεύγος οξέος/βάσης διόξινο φωσφορικό/όξινο φωσφορικό (H 2 PO 4 -/ HPO 4 ) ως ρυθμιστικό σύστημα. Αυτό το ρυθμιστικό σύστημα είναι ιδανικό για τη διεξαγωγή πειραμάτων βιολογικής και ιατρικής φύσης, καθώς το διόξινο φωσφορικό (επίσης ονομάζεται φωσφορικό διόξινο) έχει pKa 7,2, επομένως ένα ισομοριακό διάλυμα του συζευγμένου ζεύγους ρυθμίζει το pH γύρω στο 7. .2, προσομοιώνοντας επαρκώς το φυσιολογικό pH του ανθρώπου.

Εκτός από τη σωστή μοντελοποίηση του pH διαφόρων σωματικών υγρών, το διάλυμα PBS έχει επίσης ορισμένα διαλυμένα άλατα, όπως χλωριούχο νάτριο, χλωριούχο κάλιο και σε ορισμένες περιπτώσεις χλωριούχο ασβέστιο και μαγνήσιο. Μαζί, τα άλατα και τα φωσφορικά άλατα παρέχουν στο διάλυμα μια οσμωτικότητα ισοδύναμη με αυτή του πλάσματος αίματος (περίπου 290 mOsm/L), καθιστώντας το ένα ισοτονικό διάλυμα, ιδανικό για τη μελέτη κυττάρων και άλλων συστημάτων υπό φυσιολογικές συνθήκες.

Σύνθεση του ρυθμιστικού διαλύματος PBS

Υπάρχουν διάφορα σκευάσματα που εμπίπτουν στην κατηγορία του φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά.

Το διάλυμα αυτό πρέπει να περιέχει τουλάχιστον χλωριούχο νάτριο ως κύριο άλας (από το οποίο προέρχεται ο όρος αλατούχο διάλυμα) και πρέπει επίσης να περιέχει τουλάχιστον ένα άλας ενός από τα δύο συστατικά του ρυθμιστικού συστήματος. Θα μπορούσε να είναι διόξινο φωσφορικό νάτριο ή κάλιο ή θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί όξινο φωσφορικό νάτριο ή κάλιο.

Στην πρώτη περίπτωση, μια ισχυρή βάση όπως το υδροξείδιο του νατρίου πρέπει επίσης να προστεθεί για να εξουδετερώσει το μισό του άλατος οξέος και έτσι να δημιουργήσει το πλήρες σύστημα ρυθμιστικού διαλύματος. Στη δεύτερη περίπτωση, ξεκινάμε παρουσία μόνο του βασικού άλατος, οπότε πρέπει να εξουδετερώσουμε το μισό για να δημιουργήσουμε αρκετό συζευγμένο οξύ.

Ένα τυπικό παράδειγμα της σύνθεσης ενός από αυτά τα διαλύματα PBS είναι:

  • Χλωριούχο νάτριο (NaCl) 140 mM.
  • 12 mM όξινο φωσφορικό νάτριο.
  • Υδροχλωρικό οξύ μέχρι να φτάσει το επιθυμητό pH.

Ωστόσο, στην πιο συνηθισμένη περίπτωση, το διάλυμα PBS προσπαθεί να προσομοιώσει όσο το δυνατόν περισσότερο τα χαρακτηριστικά των βιολογικών υγρών, τα οποία περιλαμβάνουν ιόντα εκτός του νατρίου, τα διάφορα φωσφορικά και χλωριούχα. Για το λόγο αυτό, τα διαλύματα PBS είναι συνήθως ελαφρώς πιο περίπλοκα από αυτά που περιγράφηκαν παραπάνω. Στα διαλύματα των οποίων η παρασκευή περιγράφεται παρακάτω, οι τελικές συγκεντρώσεις των σχετικών ιοντικών ειδών πριν από τη ρύθμιση του pH είναι:

Ιόν Συγκέντρωση (mM)
Μπα + 157
Κ + 4.5
Ca 2+ 1
mg 2+ 0,5
Cl 142,7
φωσφορικά άλατα 11.8

Η συγκεκριμένη συγκέντρωση ιόντων όξινου φωσφορικού (HPO 4 2- ) και διόξινο φωσφορικού (H 2 PO 4 ) , των κυρίαρχων ειδών σε ισορροπία σε τιμές pH κοντά στο 7, θα εξαρτηθεί από το συγκεκριμένο pH στο οποίο ρυθμίζεται το διάλυμα. Για παράδειγμα, εάν το pH φτάσει στο 7,2, το pKa του διόξινου φωσφορικού, και τα δύο ιόντα θα είναι σε αναλογία 1:1 με συγκεντρώσεις γύρω στα 5,9 mM.

Ακολουθεί το πρωτόκολλο για την παρασκευή ενός τυπικού διαλύματος PBS για εργαστηριακή χρήση που, εκτός από φωσφορικά, χλωριούχα και ιόντα νατρίου, περιέχει επίσης ιόντα καλίου, ασβεστίου και μαγνησίου.

Παρασκευή φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά

Υπάρχουν δύο τυπικοί τρόποι παρασκευής ενός διαλύματος PBS για χρήση σε εργαστήριο βιολογίας, ιατρικής ή βιοχημείας: με ζύγιση και απευθείας διάλυση των απαραίτητων αλάτων ή με αραίωση ενός πιο συμπυκνωμένου διαλύματος.

Και οι δύο διαδικασίες δίνουν το ίδιο αποτέλεσμα, αλλά η δεύτερη είναι πολύ πιο πρακτική σε εργαστήρια όπου αυτό το διάλυμα χρησιμοποιείται συχνά. Αυτό συμβαίνει επειδή, με την παρασκευή μόνο ενός συμπυκνωμένου διαλύματος, οποιαδήποτε απαιτούμενη αραίωση μπορεί να παρασκευαστεί γρήγορα τη στιγμή που χρειάζεται, μια διαδικασία που είναι πολύ πιο γρήγορη και λιγότερο επιρρεπής σε σφάλματα από το ζύγισμα και τη διάλυση 4 έως 6 διαφορετικών αλάτων. κάθε φορά ένα διάλυμα πρέπει να προετοιμαστεί.

Παρασκευή διαλύματος 1x PBS με απευθείας ζύγιση

Ο παρακάτω πίνακας περιέχει τις μάζες των διαφόρων συστατικών που πρέπει να ζυγιστούν για να παρασκευαστούν 250 mL, 500 mL και 1 L τυπικού διαλύματος PBS με pH μεταξύ 7,2 και 7,4 και ωσμωτικότητα περίπου 290 mOsm/L. Αυτό το διάλυμα συνήθως ονομάζεται PBS 1x αφού είναι αυτό με την κατάλληλη συγκέντρωση για χρήση σε πειράματα.

διαλυτό Μοριακή μάζα της διαλυμένης ουσίας (g/mol) Μάζα διαλυμένης ουσίας (g) για 250 mL (g) Μάζα διαλυμένης ουσίας (g) για 500 mL Μάζα διαλυμένης ουσίας (g) για 1 L Ονομαστική συγκέντρωση (mM)
NaCl 58,44 2.002 4.003 8.006 137
KCl 74.548 0,050 0,101 0,201 2.7
Na2HPO4 _ _ _ 141.958 0,355 0,710 1.420 10
KH 2 PO 4 136.084 0,061 0,122 0,245 1.8
CaCl 2 • 2H 2 O (προαιρετικό) 147.008 0,037 0,074 0,147 1
MgCl 2 • 6H 2 O (προαιρετικό) 203.295 0,025 0,051 0,102 0,5

πρωτόκολλο προετοιμασίας

Η παρασκευή αυτών των διαλυμάτων πραγματοποιείται με τα ακόλουθα βήματα:

  1. Όλα τα άλατα ζυγίζονται χωριστά χρησιμοποιώντας αναλυτικό ζυγό.
  2. Σε ένα ποτήρι ζέσεως ή ποτήρι ζέσεως κατάλληλου μεγέθους, προσθέστε νερό για να συμπληρώσετε έως τα τέσσερα πέμπτα του συνολικού όγκου του διαλύματος που θα παρασκευαστεί (200 mL νερού για το διάλυμα των 250 mL, 400 mL για το διάλυμα των 500 mL ή Εάν είναι δυνατόν, χρησιμοποιήστε υπερκαθαρό (απιονισμένο) νερό. Δεν είναι απαραίτητο να μετρήσετε αυτή την ποσότητα νερού με μεγάλη ακρίβεια.
  3. Προσθέστε ένα ένα τα προηγουμένως ζυγισμένα άλατα και ανακινήστε με μαγνητικό αναδευτήρα ή γυάλινη ράβδο μέχρι να διαλυθεί τελείως. Το προκύπτον διάλυμα θα πρέπει να έχει περισσότερο αλκαλικό pH περίπου 7,8 ή 7,9.
  4. Χρησιμοποιώντας ένα pH-meter ή pHmeter και υπό συνεχή ανάδευση, προσθέστε διάλυμα υδροχλωρικού οξέος 0,1 M (HCl) μέχρι να επιτευχθεί το επιθυμητό pH. Για να επιτευχθεί ένα pH περίπου 7,4 στο διάλυμα του 1 L, θα χρειαστούν περίπου 30 mL HCl 0,1 M. Για τα άλλα δύο, θα χρειαστούν αναλογικά μικρότερες ποσότητες.
  5. Μόλις επιτευχθεί το επιθυμητό pH, μεταφέρετε το διάλυμα σε ογκομετρική φιάλη κατάλληλης χωρητικότητας (250 mL, 500 mL ή 1 L, ανάλογα με την περίπτωση).
  6. Μόλις μπείτε στην ογκομετρική φιάλη, προσθέστε υπερκαθαρό νερό μέχρι την ένδειξη μέτρησης.
  7. Με το πώμα του μπαλονιού στη θέση του, ανακινήστε το διάλυμα για να βεβαιωθείτε ότι το διάλυμα είναι ομοιογενές.

Παρασκευή διαλύματος 10x PBS με απευθείας ζύγιση

Το διάλυμα 10x PBS είναι μια δέκα φορές πιο συμπυκνωμένη έκδοση του τυπικού διαλύματος. Αυτό το διάλυμα δεν χρησιμοποιείται για τη διεξαγωγή πειραμάτων, αλλά ως συμπυκνωμένο διάλυμα για την παρασκευή του προτύπου διαλύματος με αραίωση.

Ο παρακάτω πίνακας περιέχει τις μάζες των διαφόρων συστατικών που πρέπει να ζυγιστούν για να παρασκευαστούν 250 mL, 500 mL και 1 L διαλύματος 10x PBS με pH μεταξύ 7,2 και 7,4 και ωσμωτικότητα περίπου 2,90 Osm/L.

διαλυτό Μοριακή μάζα της διαλυμένης ουσίας (g/mol) Μάζα διαλυμένης ουσίας (g) για 250 mL (g) Μάζα διαλυμένης ουσίας (g) για 500 mL Μάζα διαλυμένης ουσίας (g) για 1 L Ονομαστική συγκέντρωση (mM)
NaCl 58,44 20.0157 40,0314 80,0628 1370
KCl 74.548 0,503199 1,006398 2,012796 27
Na2HPO4 _ _ _ 141.958 3,54895 7,0979 14,1958 100
KH 2 PO 4 136.084 0,612378 1,224756 2,449512 18
CaCl 2 • 2H 2 O (προαιρετικό) 147.008 0,36752 0,73504 1,47008 10
MgCl 2 • 6H 2 O (προαιρετικό) 203.295 0,25411875 0,5082375 1,016475 5

πρωτόκολλο προετοιμασίας

Η παρασκευή οποιουδήποτε από τα συμπυκνωμένα διαλύματα πραγματοποιείται ακολουθώντας τα ίδια βήματα όπως στην προηγούμενη περίπτωση. Οι μόνες σημαντικές αλλαγές είναι οι μάζες των διαλυμένων ουσιών, οι οποίες είναι δέκα φορές μεγαλύτερες.

Από την άλλη, δεδομένου ότι είναι πολύ πιο συμπυκνωμένο διάλυμα, η ρύθμιση του pH θα πρέπει να γίνεται και με ένα πιο συμπυκνωμένο διάλυμα HCl, κατά προτίμηση 1 M. Δεν πρέπει να γίνεται με το ίδιο διάλυμα 0,1 M, καθώς ο όγκος που θα χρειαστεί για να επιτευχθεί ένα pH μεταξύ 7,2 και 7,4 θα καταλήξει να υπερβαίνει τον τελικό συνολικό όγκο του διαλύματος που θέλετε να παρασκευάσετε.

Παρασκευή διαλύματος 1x PBS με αραίωση διαλύματος 10x

Το 10x πυκνό διάλυμα που περιγράφεται στην προηγούμενη ενότητα χρησιμοποιείται ως μητρικό ή μητρικό διάλυμα για την παρασκευή επί τόπου μικρών ποσοτήτων διαλύματος 1x PBS. Ο παρακάτω πίνακας δείχνει τις ποσότητες του συμπυκνωμένου διαλύματος που πρέπει να μετρηθούν σύμφωνα με την ποσότητα 1x διαλύματος PBS που θέλετε να παρασκευάσετε.

Όγκος 1x PBS για προετοιμασία (mL) Όγκος 10x PBS προς μέτρηση (mL)
10 1
25 2.5
πενήντα 5
100 10
250 25
500 πενήντα
1000 100

πρωτόκολλο προετοιμασίας

Σε όλες τις περιπτώσεις, η παρασκευή των αραιώσεων απαιτεί τη χρήση ογκομετρικής πιπέτας της οποίας η χωρητικότητα είναι ίση με τον όγκο του προς μέτρηση διαλύματος 10x, καθώς και ογκομετρικής φιάλης της οποίας ο όγκος είναι ίσος με την ποσότητα του επιθυμητού διαλύματος. προετοιμάζω.

Τα βήματα είναι τα εξής:

  1. Βεβαιωθείτε ότι το συμπυκνωμένο διάλυμα δεν έχει καταβυθιστεί. Αν ναι, ανακινήστε το μέχρι να διαλυθεί τελείως.
  2. Ρίξτε μια ελαφρώς μεγαλύτερη ποσότητα του διαλύματος 10x PBS που πρόκειται να μετρηθεί σε ένα ποτήρι ζέσεως κατάλληλου μεγέθους.
  3. Χρησιμοποιώντας κατάλληλη ογκομετρική πιπέτα (όπως περιγράφεται παραπάνω) μετρήστε τον αντίστοιχο όγκο του συμπυκνωμένου διαλύματος και προσθέστε το στην κατάλληλη ογκομετρική φιάλη.
  4. Προσθέστε νερό μέχρι την ένδειξη χωρητικότητας.
  5. Με το πώμα του μπαλονιού στη θέση του, ανακινήστε το διάλυμα για να βεβαιωθείτε ότι το διάλυμα είναι ομοιογενές.

Αποστείρωση και αποθήκευση διαλυμάτων PBS

Αν και αυτά τα διαλύματα μπορούν σχεδόν πάντα να χρησιμοποιηθούν αμέσως μετά την παρασκευή, ορισμένες εφαρμογές φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά απαιτούν να αποστειρωθεί πρώτα. Σε αυτές τις περιπτώσεις, αρκεί μια 20λεπτη αποστείρωση σε αυτόκλειστο στα 15 psi.

Όσον αφορά την αποθήκευση, τα διαλύματα 1x και 10x PBS μπορούν να αποθηκευτούν σε θερμοκρασία δωματίου.

Εάν είναι απαραίτητο, μπορούν επίσης να αποθηκευτούν στο ψυγείο για να παρατείνουν τη διάρκεια ζωής τους. Στην περίπτωση της τυπικής λύσης, η ψύξη δεν προκαλεί κανένα πρόβλημα. Ωστόσο, στην περίπτωση του διαλύματος 10x, που είναι ένα σχετικά συμπυκνωμένο διάλυμα, η ψύξη μπορεί να προκαλέσει την καθίζηση ορισμένων αλάτων, ειδικά εάν το διάλυμα περιέχει ασβέστιο και μαγνήσιο.

Η κατακρήμνιση κανονικά δεν αποτελεί πρόβλημα, εφόσον λαμβάνονται μέτρα για την επαναδιάλυση όλων των διαλυμένων ουσιών πριν από τη χρήση αυτού του διαλύματος για την παρασκευή των αντίστοιχων αραιώσεων. Για να επιτευχθεί αυτό, αρκεί να αφήσετε το διάλυμα να φτάσει σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια να το ανακινήσετε μέχρι να διαλυθούν όλα τα στερεά που σχηματίζονται. Εάν είναι απαραίτητο, το διάλυμα μπορεί επίσης να θερμανθεί ελαφρά για να βοηθήσει στην ταχύτερη διάλυση των διαλυμένων ουσιών.

βιβλιογραφικές αναφορές

AAT Bioquest, Inc. (2021, 20 Οκτωβρίου). PBS (Φωσφορικό Ρυθμιστικό Αλατούχο διάλυμα) (1Χ, pH 7,4).» . Ανακτήθηκε από https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/pbs-phosphate-buffered-saline

Checa R., A. (2017, 13 Δεκεμβρίου). Μέθοδος: Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) . ξέρω. http://conogasi.org/articulos/metodo-disolucion-amortiguadora-de-fosfastos-pbs/

Gil, M. (2019, 17 Απριλίου). Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS): λογική, προετοιμασία και χρήσεις . κατάδικος διά βίου. https://www.lifeder.com/buffer-phosphates/

-Διαφήμιση-

Israel Parada (Licentiate,Professor ULA)
Israel Parada (Licentiate,Professor ULA)
(Licenciado en Química) - AUTOR. Profesor universitario de Química. Divulgador científico.

Artículos relacionados