Wie man eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung herstellt

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS-Lösung ist eine pH-Pufferlösung, die üblicherweise in Biologielabors auf der ganzen Welt verwendet wird. Es handelt sich um eine Lösung verschiedener Salze, die als Puffersystem das Säure/Base-Paar Dihydrogenphosphat/Hydrogenphosphat (H ₂ PO ₄ ^-/ HPO ₄ ^{– ) aufweist.} Dieses Puffersystem ist ideal für die Durchführung von Experimenten biologischer und medizinischer Natur, da Dihydrogenphosphat (auch Disäurephosphat genannt) einen pKa-Wert von 7,2 hat, so dass eine äquimolare Lösung des konjugierten Paares den pH-Wert um 7,2 reguliert und damit ausreichend simuliert der physiologische pH-Wert des Menschen.

Neben der korrekten Modellierung des pH-Werts verschiedener Körperflüssigkeiten enthält die PBS-Lösung auch einige gelöste Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und in einigen Fällen Calcium- und Magnesiumchlorid. Zusammen verleihen die Salze und Phosphate der Lösung eine Osmolarität, die der von Blutplasma entspricht (ca. 290 mOsm/L), was sie zu einer isotonischen Lösung macht, die sich ideal für die Untersuchung von Zellen und anderen Systemen unter physiologischen Bedingungen eignet.

Zusammensetzung des PBS-Puffers

Es gibt verschiedene Formulierungen, die unter die Kategorie der phosphatgepufferten Kochsalzlösung fallen.

Diese Lösung muss mindestens Natriumchlorid als Hauptsalz (daher der Begriff Kochsalzlösung) und zusätzlich mindestens ein Salz einer der beiden Komponenten des Puffersystems enthalten. Es könnte Natrium- oder Kaliumdihydrogenphosphat sein, oder es könnte auch Natrium- oder Kaliumhydrogenphosphat verwendet werden.

Im ersten Fall muss zusätzlich eine starke Base wie Natriumhydroxid zugegeben werden, um die Hälfte des Säuresalzes zu neutralisieren und so das vollständige Puffersystem zu erzeugen. Im zweiten Fall beginnen wir nur in Gegenwart des basischen Salzes, also müssen wir die Hälfte davon neutralisieren, um genügend konjugierte Säure zu erzeugen.

Ein typisches Beispiel für die Zusammensetzung einer dieser PBS-Lösungen ist:

• Natriumchlorid (NaCl) 140 mM.
• 12 mM Natriumhydrogenphosphat.
• Salzsäure bis zum Erreichen des gewünschten pH-Wertes.

Im häufigsten Fall versucht die PBS-Lösung jedoch, so weit wie möglich die Eigenschaften biologischer Flüssigkeiten zu simulieren, die andere Ionen als Natrium, die verschiedenen Phosphate und Chloride umfassen. Aus diesem Grund sind PBS-Lösungen in der Regel etwas komplexer als oben beschrieben. In den Lösungen, deren Herstellung unten beschrieben wird, betragen die Endkonzentrationen der relevanten Ionenspezies vor der Einstellung des pH-Werts:

_{Die jeweilige Konzentration von Hydrogenphosphat (HPO 4} ^2– )- und Dihydrogenphosphat (H ₂ PO ₄ ^– ) -Ionen , die dominierende Spezies im Gleichgewicht bei pH-Werten nahe 7, hängt von dem jeweiligen pH-Wert ab, auf den die Lösung eingestellt wird. Wenn beispielsweise der pH-Wert auf 7,2 gebracht wird, dem pKa von Dihydrogenphosphat, liegen beide Ionen in einem Verhältnis von 1:1 mit Konzentrationen um 5,9 mM vor.

Das Folgende ist das Protokoll für die Herstellung einer typischen PBS-Lösung für den Laborgebrauch, die neben Phosphaten, Chloriden und Natriumionen auch Kalium-, Calcium- und Magnesiumionen enthält.

Herstellung von phosphatgepufferter Kochsalzlösung

Es gibt zwei typische Möglichkeiten, eine PBS-Lösung für die Verwendung in einem Biologie-, Medizin- oder Biochemielabor herzustellen: durch Wiegen und direktes Auflösen der erforderlichen Salze oder durch Verdünnen einer konzentrierteren Lösung.

Beide Verfahren liefern das gleiche Ergebnis, aber das zweite ist in Laboratorien, in denen diese Lösung häufig verwendet wird, viel praktischer. Denn durch die Herstellung nur einer konzentrierten Lösung kann jede erforderliche Verdünnung schnell zum gewünschten Zeitpunkt hergestellt werden, ein Vorgang, der viel schneller und weniger fehleranfällig ist als das Einwiegen und Auflösen von 4 bis 6 verschiedenen Salzen für jede Lösung muss vorbereitet werden.

Herstellung einer 1x PBS-Lösung durch direktes Wiegen

Die folgende Tabelle enthält die Massen der verschiedenen Komponenten, die gewogen werden müssen, um 250 ml, 500 ml und 1 l PBS-Standardlösung mit einem pH-Wert zwischen 7,2 und 7,4 und einer Osmolarität von etwa 290 mOsm/l herzustellen. Diese Lösung wird normalerweise als PBS 1x bezeichnet, da sie diejenige mit der geeigneten Konzentration für die Verwendung in Experimenten ist.

Vorbereitungsprotokoll

Die Herstellung dieser Lösungen erfolgt in folgenden Schritten:

1. Alle Salze werden separat mit einer Analysenwaage gewogen.
2. Geben Sie in einem Becher geeigneter Größe Wasser hinzu, um bis zu vier Fünftel des Gesamtvolumens der herzustellenden Lösung aufzufüllen (200 ml Wasser für die 250-ml-Lösung, 400 ml für die 500-ml-Lösung oder Verwenden Sie nach Möglichkeit Reinstwasser (deionisiertes Wasser). Es ist nicht erforderlich, diese Wassermenge sehr genau zu messen.
3. Die zuvor abgewogenen Salze einzeln zugeben und mit einem Magnetrührer oder einem Glasstab schütteln, bis sie vollständig gelöst sind. Die resultierende Lösung sollte einen alkalischeren pH-Wert von etwa 7,8 oder 7,9 haben.
4. Mit einem pH-Meter oder pH-Meter und unter ständigem Rühren 0,1 M Salzsäure (HCl)-Lösung zugeben, bis der gewünschte pH-Wert erreicht ist. Um einen pH-Wert von etwa 7,4 in der 1-Liter-Lösung zu erreichen, werden etwa 30 ml 0,1 M HCl benötigt, für die anderen beiden werden proportional kleinere Mengen benötigt.
5. Sobald der gewünschte pH-Wert erreicht ist, überführen Sie die Lösung in einen Messkolben mit geeignetem Fassungsvermögen (je nach Fall 250 ml, 500 ml oder 1 l).
6. Im Messkolben Reinstwasser bis zur Messmarke zugeben.
7. Schütteln Sie die Lösung mit aufgesetztem Ballonstopfen, um sicherzustellen, dass die Lösung homogen ist.

Herstellung einer 10x PBS-Lösung durch direktes Wiegen

Die 10x PBS-Lösung ist eine zehnmal höher konzentrierte Version der Standardlösung. Diese Lösung wird nicht zur Durchführung von Experimenten verwendet, sondern als konzentrierte Lösung zur Herstellung der Standardlösung durch Verdünnung.

Die folgende Tabelle enthält die Massen der verschiedenen Komponenten, die gewogen werden müssen, um 250 ml, 500 ml und 1 l 10x PBS-Lösung mit einem pH-Wert zwischen 7,2 und 7,4 und einer Osmolarität von etwa 2,90 Osm/l herzustellen.

Vorbereitungsprotokoll

Die Herstellung jeder der konzentrierten Lösungen wird durch Befolgen der gleichen Schritte wie im vorherigen Fall durchgeführt. Die einzigen wichtigen Änderungen sind die Massen der gelösten Stoffe, die zehnmal größer sind.

Da es sich andererseits um eine viel konzentriertere Lösung handelt, sollte die pH-Einstellung auch mit einer konzentrierteren HCl-Lösung durchgeführt werden, vorzugsweise 1 M. Sie sollte nicht mit der gleichen 0,1 M-Lösung durchgeführt werden, da das Volumen das benötigt wird, um einen pH-Wert zwischen 7,2 und 7,4 zu erreichen, übersteigt am Ende das endgültige Gesamtvolumen der Lösung, die Sie herstellen möchten.

Herstellung einer 1x PBS-Lösung durch Verdünnung einer 10x-Lösung

Die im vorherigen Abschnitt beschriebene 10-fach konzentrierte Lösung wird als Stamm- oder Mutterlösung für die sofortige Herstellung kleiner Mengen 1-fach PBS-Lösung verwendet. Die folgende Tabelle gibt die Mengen an konzentrierter Lösung an, die entsprechend der Menge an 1x PBS-Lösung, die Sie herstellen möchten, abgemessen werden müssen.

Vorbereitungsprotokoll

In jedem Fall erfordert die Herstellung der Verdünnungen die Verwendung einer Vollpipette, deren Fassungsvermögen dem Volumen der zu messenden 10x-Lösung entspricht, sowie eines Meßkolbens, dessen Volumen der gewünschten Lösungsmenge entspricht. vorbereiten.

Die Schritte sind die folgenden:

1. Stellen Sie sicher, dass die konzentrierte Lösung nicht ausgefallen ist. Wenn ja, schütteln Sie es, bis es vollständig aufgelöst ist.
2. Gießen Sie eine etwas größere Menge der zu messenden 10x PBS-Lösung in ein Becherglas geeigneter Größe.
3. Mit einer geeigneten Volumenmesspipette (wie oben beschrieben) das entsprechende Volumen der konzentrierten Lösung abmessen und in den entsprechenden Messkolben geben.
4. Füllen Sie Wasser bis zur Füllstandsmarke ein.
5. Schütteln Sie die Lösung mit aufgesetztem Ballonstopfen, um sicherzustellen, dass die Lösung homogen ist.

Sterilisation und Lagerung von PBS-Lösungen

Obwohl diese Lösungen fast immer sofort nach der Zubereitung verwendet werden können, erfordern einige Anwendungen von phosphatgepufferter Kochsalzlösung, dass sie zuerst sterilisiert werden. In diesen Fällen ist eine 20-minütige Sterilisation in einem Autoklaven bei 15 psi ausreichend.

Hinsichtlich der Lagerung können sowohl 1x als auch 10x PBS-Lösungen bei Raumtemperatur gelagert werden.

Bei Bedarf können sie auch gekühlt gelagert werden, um ihre Haltbarkeit zu verlängern. Bei der Standardlösung bereitet die Kühlung keine Probleme. Im Fall der 10x-Lösung, die eine relativ konzentrierte Lösung ist, kann das Abkühlen jedoch zur Ausfällung einiger Salze führen, insbesondere wenn die Lösung Calcium und Magnesium enthält.

Die Ausfällung ist normalerweise kein Problem, solange Schritte unternommen werden, um alle gelösten Stoffe wieder aufzulösen, bevor diese Lösung zur Herstellung der jeweiligen Verdünnungen verwendet wird. Dazu genügt es, die Lösung auf Raumtemperatur kommen zu lassen und dann zu schütteln, bis alle gebildeten Feststoffe gelöst sind. Falls erforderlich, kann die Lösung auch leicht erhitzt werden, um die gelösten Stoffe schneller aufzulösen.

Verweise

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