Как се приготвя физиологичен разтвор с фосфатен буфер

Фосфатно буфериран физиологичен разтвор или PBS разтвор е pH буферен разтвор, който обикновено се използва в биологичните лаборатории по целия свят. Това е разтвор на различни соли, който има двойката киселина/основа дихидроген фосфат/хидроген фосфат (H ₂ PO ₄ ^-/ HPO ₄ ^– ) като буферна система. Тази буферна система е идеална за провеждане на експерименти от биологично и медицинско естество, тъй като дихидроген фосфатът (наричан още двукиселинен фосфат) има pKa от 7,2, така че еквимоларен разтвор на конюгираната двойка регулира рН около 7. .2, адекватно симулиращ физиологичното pH на човека.

В допълнение към правилното моделиране на рН на различни телесни течности, PBS разтворът има и някои разтворени соли, като натриев хлорид, калиев хлорид и в някои случаи калциев и магнезиев хлорид. Заедно солите и фосфатите осигуряват на разтвора осмоларност, еквивалентен на този на кръвната плазма (около 290 mOsm/L), което го прави изотоничен разтвор, идеален за изследване на клетки и други системи при физиологични условия.

Състав на PBS буфера

Има различни формулировки, които попадат в категорията на фосфатно буфериран физиологичен разтвор.

Като минимум този разтвор трябва да съдържа натриев хлорид като основна сол (откъдето идва терминът физиологичен разтвор) и също така трябва да съдържа поне една сол на един от двата компонента на буферната система. Може да бъде натриев или калиев дихидроген фосфат, или може да се използва и натриев или калиев хидроген фосфат.

В първия случай трябва също да се добави силна основа като натриев хидроксид, за да се неутрализира половината от киселинната сол и по този начин да се създаде пълната буферна система. Във втория случай започваме в присъствието само на основната сол, така че трябва да неутрализираме половината от нея, за да генерираме достатъчно спрегната киселина.

Типичен пример за състава на един от тези PBS разтвори е:

• Натриев хлорид (NaCl) 140 тМ.
• 12 mM натриев хидроген фосфат.
• Солна киселина до достигане на желаното pH.

Въпреки това, в най-често срещания случай PBS разтворът се опитва да симулира колкото е възможно повече характеристиките на биологичните течности, които включват йони, различни от натрий, различни фосфати и хлориди. Поради тази причина PBS решенията обикновено са малко по-сложни от описаните по-горе. В разтворите, чието приготвяне е описано по-долу, крайните концентрации на съответните йонни видове преди коригиране на pH са:

_{Конкретната концентрация на хидроген фосфат (HPO 4} ^2- ) и дихидроген фосфат (H ₂ PO ₄ ^– ) йони , доминиращите видове в равновесие при стойности на рН близо до 7, ще зависи от конкретното рН, до което се регулира разтворът. Например, ако pH се доведе до 7,2, pKa на дихидроген фосфат, двата йона ще бъдат в съотношение 1:1 с концентрации около 5,9 mM.

Следва протоколът за приготвяне на типичен разтвор на PBS за лабораторна употреба, който освен фосфати, хлориди и натриеви йони съдържа също калиеви, калциеви и магнезиеви йони.

Приготвяне на фосфатно буфериран физиологичен разтвор

Има два типични начина за приготвяне на разтвор на PBS за използване в лаборатория по биология, медицина или биохимия: чрез претегляне и директно разтваряне на необходимите соли или чрез разреждане на по-концентриран разтвор.

И двете процедури дават еднакъв резултат, но втората е много по-практична в лаборатории, където този разтвор се използва често. Това е така, защото чрез приготвянето само на един концентриран разтвор всяко необходимо разреждане може да бъде бързо приготвено в момента, в който е необходимо, процедура, която е много по-бърза и по-малко податлива на грешки, отколкото претеглянето и разтварянето на 4 до 6 различни соли. всеки път, когато разтвор трябва да бъдат подготвени.

Приготвяне на 1x PBS разтвор чрез директно претегляне

Следващата таблица съдържа масите на различните компоненти, които трябва да бъдат претеглени, за да се приготвят 250 mL, 500 mL и 1 L стандартен разтвор на PBS с рН между 7,2 и 7,4 и осмоларност приблизително 290 mOsm/L. Този разтвор обикновено се нарича PBS 1x, тъй като е този с подходящата концентрация за използване в експерименти.

подготвителен протокол

Приготвянето на тези разтвори се извършва чрез следните стъпки:

1. Всички соли се претеглят отделно с помощта на аналитична везна.
2. В чаша с подходящ размер или чаша добавете вода, за да достигнете до четири пети от общия обем на разтвора, който трябва да се приготви (200 mL вода за 250 mL разтвор, 400 mL за 500 mL разтвор или Ако е възможно, използвайте свръхчиста (дейонизирана) вода. Не е необходимо това количество вода да се измерва много точно.
3. Добавете една по една предварително претеглените соли и разклатете с магнитна бъркалка или стъклена пръчка до пълното им разтваряне. Полученият разтвор трябва да има по-алкално pH от около 7,8 или 7,9.
4. С помощта на рН-метър или рН-метър и при постоянно разбъркване добавете 0,1 М разтвор на солна киселина (HCl) до достигане на желаното рН. За да се достигне рН от около 7,4 в 1 L разтвор, ще са необходими около 30 ml 0,1 M HCl.За другите две ще са необходими пропорционално по-малки количества.
5. След като се достигне желаното рН, прехвърлете разтвора в мерителна колба с подходящ капацитет (250 mL, 500 mL или 1 L, в зависимост от случая).
6. След като попаднете в мерителната колба, добавете свръхчиста вода до маркировката за измерване.
7. С поставена балонна запушалка, разклатете разтвора, за да сте сигурни, че разтворът е хомогенен.

Приготвяне на 10x PBS разтвор чрез директно претегляне

Разтворът 10x PBS е десет пъти по-концентрирана версия на стандартния разтвор. Този разтвор не се използва за извършване на експерименти, а като концентриран разтвор за приготвяне на стандартния разтвор чрез разреждане.

Следващата таблица съдържа масите на различните компоненти, които трябва да бъдат претеглени, за да се приготвят 250 mL, 500 mL и 1 L 10x PBS разтвор с pH между 7,2 и 7,4 и осмоларност приблизително 2,90 Osm/L.

подготвителен протокол

Приготвянето на всеки от концентрираните разтвори се извършва, като се следват същите стъпки, както в предишния случай. Единствените важни промени са масите на разтворените вещества, които са десет пъти по-големи.

От друга страна, тъй като това е много по-концентриран разтвор, корекцията на рН също трябва да се извърши с по-концентриран разтвор на HCl, за предпочитане 1 М. Не трябва да се извършва със същия 0,1 М разтвор, тъй като обемът, който ще са необходими за достигане на рН между 7,2 и 7,4, в крайна сметка ще надвишат крайния общ обем на разтвора, който искате да приготвите.

Приготвяне на 1x PBS разтвор чрез разреждане на 10x разтвор

10x концентрираният разтвор, описан в предишния раздел, се използва като изходен или майчин разтвор за приготвяне на място на малки количества от 1x PBS разтвор. Следващата таблица показва количествата концентриран разтвор, които трябва да бъдат измерени според количеството 1x PBS разтвор, което искате да приготвите.

подготвителен протокол

Във всички случаи приготвянето на разрежданията изисква използването на обемна пипета, чийто капацитет е равен на обема на 10x разтвора, който трябва да се измери, както и мерителна колба, чийто обем е равен на желаното количество разтвор. приготви се.

Стъпките са следните:

1. Уверете се, че концентрираният разтвор не се е утаил. Ако е така, разклатете го, докато се разтвори напълно.
2. Изсипете малко по-голямо количество от 10x PBS разтвора за измерване в чаша с подходящ размер.
3. С помощта на мерителна пипета за подходящ обем (както е описано по-горе) измерете съответния обем на концентрирания разтвор и го добавете в подходящата мерителна колба.
4. Добавете вода до маркировката за капацитет.
5. С поставена балонна запушалка, разклатете разтвора, за да сте сигурни, че разтворът е хомогенен.

Стерилизация и съхранение на PBS разтвори

Въпреки че тези разтвори почти винаги могат да се използват веднага след приготвянето им, някои приложения на фосфатно буфериран физиологичен разтвор изискват първо да се стерилизира. В тези случаи е достатъчна 20 минутна стерилизация в автоклав при 15 psi.

По отношение на съхранението, както 1x, така и 10x PBS разтворите могат да се съхраняват при стайна температура.

Ако е необходимо, те могат да се съхраняват и в хладилник, за да се удължи срокът им на годност. При стандартното решение охлаждането не създава никакви проблеми. Въпреки това, в случай на 10x разтвор, който е относително концентриран разтвор, охлаждането може да причини утаяване на някои соли, особено ако разтворът съдържа калций и магнезий.

Утаяването обикновено не е проблем, стига да се предприемат стъпки за повторно разтваряне на всички разтворени вещества, преди да се използва този разтвор за приготвяне на съответните разреждания. За да постигнете това, достатъчно е разтворът да достигне стайна температура и след това да се разклати, докато всички образувани твърди вещества се разтворят. Ако е необходимо, разтворът може също да се нагрее леко, за да помогне за по-бързото разтваряне на разтворените вещества.

Препратки

AAT Bioquest, Inc. (2021 г., 20 октомври). PBS (фосфатно буфериран физиологичен разтвор) (1X, pH 7,4).» . Извлечено от https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/pbs-phosphate-buffered-saline

Checa R., A. (2017, 13 декември). Метод: Фосфатен буферен разтвор (PBS) . зная. http://conogasi.org/articulos/metodo-disolucion-amortiguadora-de-fosfastos-pbs/

Гил, М. (2019 г., 17 април). Фосфатен буфер (PBS): обосновка, подготовка и употреби . доживотен затворник. https://www.lifeder.com/buffer-phosphates/